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Labeling und Konditionierung von mesenchymalen Stammzellen für das Tissue Engineering

Monitoring grün fluoreszierender MSCs mit einem Inkubatormikroskop. direkt nach Elektropration (A), in Selektionsmedium (B),
während einer osteogenen Differenzierung (C) und nach lentiviraler Transduktion (D). (Bilder generiert mit dem Inkubatormikroskop
LumaScope 600 (Etaluma, Inc., USA), Vergrößerung 40x).

AK Blume

In den letzten Jahren findet die Stammzelltherapie immer größere Verbreitung in der Behandlung von Verletzungen und Krankheiten. Dabei sind adulte humane mesenchymale Stammzellen ein vielversprechender Zelltyp, da sie autolog transplantiert werden können und damit im Vergleich zu nicht-autolog transplantierten Zellen geringere immunologische Reaktionen im Empfänger mit sich bringen. In einigen klinischen Studien ist aber bei der Stammzelltherapie Krebs aufgetreten. Ob dies im direkten Zusammenhang mit der Stammzelltherapie steht, oder ob es sich bei der Tumorentwicklung um Zufall handelt ist dabei ungewiss. Um dies herauszufinden, müssen die Stammzellen vor einer Transplantation markiert werden, damit sie nach der Transplantation eindeutig identifiziert werden können. Hierzu wurde in unserem AK eine Methodik entwickelt, bei der man diese Zellen sowohl mit green fluorescent protein als auch mit sogenannter nonsense DNA nachhaltig markieren kann, um sie anschließend entweder in der Zellkultur optisch zu verfolgen oder in Zellmaterial via PCR als Fremd-DNA nachzuweisen. Für die Transfektion der Marker in die Zielzellen wurde die Methodik der Lipofektion, die Elektroporation sowie die lentivirale Transfektion etabliert, wobei die transienten Methoden weniger zellzytoxisch sind.

Tissue Engineering ist ein stark wachsender Sektor im Bereich der zukunftsorientierten Medizin und bietet ein enormes Potential im Bereich der Entwicklung einer bioartefiziellen Gefäßprothese, welchen in einer stark alternden Gesellschaft eine immer größer werdende Bedeutung zukommt. Eines der Hauptprobleme in der Entwicklung liegt in der Isolation und Kultivierung von Endothelzellen unter dem Aspekt der autologen Transplantation. Neuste Studien zeigen jedoch, dass humane mesenchymale Stammzellen, welche aus dem Fettgewebe von Patienten isoliert wurden (hASCs), Ansätze für die Differenzierung in eine endotheliale Richtung aufweisen. Diese sogenannten „Feeder“-Zellen können auch konditionierte Kulturmedien generieren, in denen ein spezifisches Set an Wachstums- und Adhäsionsfaktoren vorhanden ist. Konditionierte Kulturmedien dienen der Kapillarnetzbildung z. B. aus Endothelzellen, die aus Nabelschnurblut isoliert wurden. Die erforderlichen Kultivierungsbedingungen wie z. B. Sauerstoffsättigung und Scherstress werden angepasst. Ein weiterer Ansatz besteht in der Charakterisierung von undifferenzierten hASCs in Hinblick auf die Differenzierung zum endothelialen Phänotyp, um damit biokompatible Scaffolds zu besiedeln.

Bioreaktorentwickung

Bioreaktorsystem für ein vascular graft mit drahtloser Ansteuerung, Pulswellen und Ultraschallmonitoring, sowie Sensoren für Temperatur, pH und Glukose.

AK Blume

Für die kliniknahe Bereitstellung und Kultivierung eines vascular graft entwickelt unsere Arbeitsgruppe außerdem einen funktionsgerechten Bioreaktor. Dieser kann im Gegensatz zu existierenden Systemen auch den Differenzierungsprozess der wachsenden Gefäßstruktur regulieren und kontrollieren. Hierfür wurden Sensorsysteme für pH, Temperatur, Druck, Glukose etc. angepasst und ein berührungsloses Monitoring über Ultraschall etabliert.

Weiterhin steht ein 3D-Drucker zur Verfügung, bei dem mit verschiedenen festen (z. B. bioresorbierbaren Polymeren) und flüssigen Materialien (z. B. Fibrin als Biotinte) gedruckt werden kann. Hier werden Scaffolds für das Tissue Engineering gedruckt und charakterisiert

Biotesting

AK Blume

Ein weiteres Aufgabengebiet der Arbeitsgruppe ist das Biotesting.

Dabei handelt es sich um das Screening unterschiedlicher pharmakologisch wirksamer Substanzen bezüglich ihrer Auswirkung auf das Proliferationsverhalten, sowie ihrer Toxizität gegenüber humanen primären Zellen und Zelllinien. Für das Screening werden sowohl etablierte Assays (CTB, MTT, ECIS, Apo ONE) verwendet, sowie neue Methoden etabliert, die versuchsspezifische Fragestellungen detaillierter einbeziehen. Dazu zählt die Toxizitätsbestimmung von modernen Immunsuppressiva in einer dynamischen 3D-Zellkultur. Sie hat sich in unseren Untersuchungen als sensitiver und geeigneter erwiesen, um tatsächliche in vivo beschriebene Nebenwirkungen verschiedener Pharmaka in toxischen Dosen zu beschreiben.

Als weitere Biotesting-Aktivität befasst sich der AK mit der Erstellung eines Lateral Flow Assays (LFA) für die Erkennung von Transplantatabstoßungen nach Nierentransplantation und arbeitet hier eng mit der Medizinischen Hochschule Hannover und der Hochschule Hannover in einem assoziierten Datenbankprojekt in einem durch EFRE-geförderten Teilprojekt zusammen. Hier sollen bestimmte, in Vorarbeiten charakterisierte Indikatorproteine aus Plasma und Urin von Abstoßungspatienten auf ein membranbasiertes LFA-Testformat aufgebracht werden, wobei sowohl Antikörper als auch Aptamere zum Nachweis der Biomarker eingesetzt werden.

Optogenetik

AK Blume

Weiterhin wird die gezielte Lichtaktivierung optogenetisch induzierbarer Proteine in Zellen untersucht. Dabei handelt es sich um Photoaktivatoren, die unter Licht die Transkription verschiedener Zielgene in der Zelle steuern können und somit die Proteinsynthese der von ihnen codierten Proteinsequenzen induzieren können. Durch diese Proteine können zellbiologische Vorgänge gesteuert werden. So sollen z. B. neuronale Zellen durch die gezielte Induktion neuroprotektiver Faktoren für die Einbringung im Rahmen von z. B. Cochleaimplantaten unterstützt werden oder angiogenetische Faktoren zur Unterstützung der Gefäßreifung beim Tissue Engineering eingesetzt und lichtgesteuert aktiviert werden.